RNAi實驗原理與方法

近年來的研究表明，將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使mRNA發生特異性的降解，導致其相應的基因沉默。這種轉錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）。

一、RNAi的分子機制

通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據表明；一個稱為Dicer的酶，是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉gene，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。

在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。

另外，還有研究證明含有啟動子區的dsRNA在植物體內同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.

RNAi演示動畫

二、如何進行RNAi試驗

(一)siRNA的設計

1. 在設計RNAi實驗時，可以先在以下網站進行目標序列的篩選：

  genesil /business/products/order2.htm

  ambion /techlib/misc/siRNA_finder.html

  ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html

 design.dharmacon /rnadesign/default.aspx?SID=45358710

2.RNAi目標序列的選取原則：

(1)從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA"二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。

Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。

(2)將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。

例如使用BLAST（  ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）

(3)選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到 的siRNA序列。

3.陰性對照

一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。

4.目前已證實的siRNA可以在下面的網頁找到：

 design.dharmacon /catalog/category.aspx?key=49

  ambion /techlib/tb/tb_502.html

 web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html

 python.penguindreams /Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published

(二)siRNA的制備

目前為止較為常用的方法有通過化學合成，體外轉錄，長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產生siRNA。

體外制備

1.化學合成

許多國外公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出 的序列再進行化學合成。

 于：已經找到 的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究

不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素

2.體外轉錄

以DNA Oligo為模版，通過體外轉錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當的時間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小，穩定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉染效率更高。

 于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。

不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。

3.用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA

其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒" 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒"。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞，方法和單一的siRNA轉染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。

dsRNA消化法的主要優點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因?，F在多數的研究顯示這種情況通常不會造成影響。

 于：快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型

不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療

體內表達

前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉染試劑將siRNAs轉到細胞內。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優點在于不需要直接操作RNA。

4. siRNA表達載體

多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數月的時間，同時也需要經過測序以保證克隆的序列是正確的。

siRNA表達載體的優點在于可以進行較長期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。

病毒載體也可用于siRNA表達，其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便,而且轉染效果更加穩定。

 于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。

不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。

5. siRNA表達框架

siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNA pol III啟動子，一段發夾結構siRNA，一個RNA pol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的 工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的 的siRNA后，可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩定表達siRNA和長效抑制的研究。

這個方法的主要缺點是①PCR產物很難轉染到細胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問題）②不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發現導致結果不理想。

 于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子

不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）

(三)siRNA的轉染

將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉導至真核細胞中的方法主要有以下幾種：

1.磷酸鈣共沉淀

將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離 條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉染的失敗。

2.電穿孔法

電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉導分子。將細胞懸浮液置于電場中會誘導沿細胞膜的電壓差異，據認為這種電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優化對于成功的轉染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。

3.DEAE-葡聚糖和polybrene

帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結合在細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復合體導入。兩種試劑都已成功用于轉染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時轉染。

4.機械法

轉染技術也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolistic particle）。顯微注射使用一根細針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉入細胞質或細胞核?；驑屖褂酶邏?/span>microprojectile將大分子導入細胞。

5.陽離子脂質體試劑

在優化條件下將陽離子脂質體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質體。這些脂質體帶正電，可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面。因此使用陽離子脂質體轉染的原理與以前利用中性脂質體轉染的原理不同。使用陽離子脂質體試劑，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物。據稱，一個約5kb的質粒會結合2-4個脂質體。被俘獲的DNA就會被導入培養的細胞?，F存對DNA轉導原理的證據來源于內吞體和溶酶體。

為了達到高的轉染效率，在轉染實驗過程中，需要注意以下幾點：

1.純化siRNA

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。

2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。

3.健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性

通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。

4.避免使用抗生素

Ambion公司推薦從細胞種植到轉染后72小時期間避免使用抗生素?？股貢诖┩傅募毎蟹e累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗，以得到最佳轉染效果。

5.選擇合適的轉染試劑

針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同，選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。

6.通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件

對大多數細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉染48小時后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。

7.通過標記siRNA來優化實驗

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。

三、RNAi的應用前景

1. 研究基因功能的新工具

已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以隨意控制在發育的任何階段，產生類似基因敲除的效應。線蟲和果蠅的全部基因組序列已測試完畢，發現大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進對這些新基因功能的研究。與傳統的基因敲除技術相比，這一技術具有投入少，周期短，操作簡單等優勢，近來RNAi成功用于構建轉基因動物模型的報道日益增多，標志著RNAi將成為研究基因功能 的工具。

2. 研究信號傳導通路的新途徑

聯合利用傳統的缺失突變技術和RNAi技術可以很容易地確定復雜的信號傳導途徑中不同基因的上下游關系，Clemensy等應用RNAi研究了果蠅細胞系中胰島素信息傳導途徑,取得了與已知胰島素信息傳導通路 一致的結果,在此基礎上分析了DSH3PX1與DACK之間的關系, 證實了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技術較傳統的轉染實驗簡單、快速、重復性好，克服了轉

染實驗中重組蛋白特異性聚集和轉染效率不高的缺點， 因此認為RNAi技術將可能成為研究細胞信號傳導通路的新途徑。

3.開展基因治療的新策略

RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉座子活動，防止自私基因序列過量增殖等作用，因此可以利用RNAi現象產生抗病毒的植物和動物，并可利用不同病毒轉錄序列中高度同源區段相應的dsRNA抵抗多種病毒。

腫瘤是多個基因相互作用的基因網絡調控的結果，傳統技術誘發的單一癌基因的阻斷不可能 抑制或逆轉腫瘤的生長, 而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性, 設計針對這一區段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產生多個基因同時剔除的表現，也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關的基因同時剔除。

盡管目前RNAi技術在哺乳動物中的應用還處于探索階段，但它在斑馬魚和老鼠等脊椎動物中的成功應用預示著RNAi將成為基因治療中重要的組成部分，人工合成的dsRNA寡聚藥物的開發將可能成為 發展前途的新興產業。